|
|
New technique on a chip for rapid detection of biological materials
Pejović Simeunović, Jelena ; Foret,, František (oponent) ; Táborský,, Petr (oponent) ; Hubálek, Jaromír (vedoucí práce)
This work proposes a technique for on-chip separation and detection of quantum dots (QDs) conjugated with various proteins in order to study the inuence of the coupling agent on a quenching of QD uorescence intensity caused by conjugation to a protein and to perform multi-analyte immunoassay to identify small amounts of the protein. Under optimal conditions, bioconjugated QDs were successfully separated from free QDs within 10 minutes. Particles and target solutions were mixed, and on-chip detection was performed using a device developed in our laboratory. Only one excitation light source was used in combination with several filters for different emission wavelengths. Fluorescence emitted by the two types of conjugated QDs could then be recorded simultaneously since the QDs emitted light at different wavelengths while being excited at the same wavelength. By mixing two types of QDs bioconjugated with two kinds of proteins and antibodies we were able to detect immunocomplex peaks with varying areas. The peak area depended on concentration of QDs and antigens, on the progress of antibody-antigen reaction and proved to be linearly correlated with the antigen concentration. We showed that on-chip capillary electrophoresis of QDs can be used as a sensitive technique for detection of biological molecules. The main benefits of this method are simplicity, small sample and reagent volume requirements, and high efciency of separation.
|
|
|
Reactive modifications of RNA for bioconjugations with proteins and new enzymatic methods for the synthesis of base-modified RNA
Brunderová, Mária ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Vaňáčová, Štěpánka (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na enzymovou syntézu na bázi modifikovaných RNA s různými funkčními skupinami, včetně reaktivních pro síťování proteinů, hydrofobních a fluorescenčních skupin nebo afinitních značek. Konstrukce oligonukleotidů modifikovaných na bázi je zabezpečena buď konvenční in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou, nebo inovativním přístupem využívajícím upravené mutantní DNA polymerázy a reakci prodlužování primerů (PEX). V první části práce byl nasyntetizován nový ribonukleosid trifosfátový stavební blok s reaktivní chloracetamidovou funkční skupinou pomocí Sonogashirovy kaplingové reakce ve vodní fázi katalyzované Pd, přímo aplikované na jodovaný nukleotid. Chloracetamidem modifikovaný trifosfát byl poté testován jako vhodný substrát pro in vitro transkripci s T7 RNA polymerázou s cílem zkonstruovat RNA sondy s jednou nebo více reaktivními skupinami. Selektivita chloracetamidem modifikovaných RNA pro thiol, nebo cystein a histidin obsahující (bio)molekuly byla ukázána modelovými biokonjugačními reakcemi a experimenty pro síťování se třemi RNA-vazebnými proteiny s různými strukturami a funkcemi. Účinná tvorba kovalentních RNA-protein aduktů byla potvrzena western blotem, gelovou elektroforézou a hmotnostní analýzou, které byly prováděny za denaturačních podmínek....
|
|
|
Syntéza self-immolativních spojek vhodných pro biokonjugace
Taraj, Lukáš ; Baszczyňski, Ondřej (vedoucí práce) ; Jindřich, Jindřich (oponent)
Self-immolativní (SI) spojky jsou chemickými konstrukty, které podléhají řízené sebe- fragmentaci na základě vhodného podnětu např. aktivace světlem nebo chemickým činidlem. SI spojky nacházejí uplatnění v cíleném doručení léčiv, v konstrukci prób pro biochemii, nebo také v různých polymerech. Cílem diplomové práce je syntéza nových SI spojek na bázi fosforu, které obsahují reaktivní chemickou funkci vhodnou pro konjugaci s thioly. Takovou funkcí bude např. vinylfosfonátová nebo alkynylfosfonátová skupina. Cílem práce bude prověřit syntézu, self- immolaci, stabilitu a možnost konjugovatelnosti takovýchto spojek s thioly např. cystein, glutation apod. Náplní práce studenta bude syntéza SI spojek, analýza získaných dat, plánování a monitorování chemických experimentů, a psaní diplomové práce. Klíčová slova: self-immolativní, biokonjugace, fosfor, doručení léčiv
|
|
|
Modification of nucleic acids by reactive groups for bioconjugations and cross-linking with lysine-containing peptides and proteins
Ivancová, Ivana
V první části dizertační práce jsem vyvinula reaktivní DNA sondu pro selektivní cross- linkování s lysinovými zbytky DNA vazebních proteinů. Připravila jsem 2'-deoxycytidin 5'-O- monofosfát a trifosfát nesoucí v poloze 5 squramátovou skupinu navázanou přes propargylaminovou spojku. Monofosfát byl použit jako modelová sloučenina na testování reaktivity tohoto smíšeného squaramátu v cross-linkových reakcích s lysinem a krátkými peptidy obsahujícími lysin. Squaramátem modifikovaný 2'-deoxycytidin 5'-O-trifosfát byl dobrým substrátem pro KOD XL polymerázu pro enzymovou syntézu DNA metodou extenze primeru (PEX) a taky metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). Squaramátem modifikovaná DNA tvoří stabilní diamidové vazby s primárními aminy. Reaktivitu modifikované DNA jsem testovala v biokonjugačních reakcích se sulfo-Cy5- aminem a s peptidy obsahujícími lysin. Poté byla squaramátem modifikovaná DNA úspěšně kovalentně připojena k histonovým proteinům bohatým na lysin. Reaktivní, squaramátem modifikovaný nukleotid vykazoval potenciál pro další biokonjugační reakce nukleových kyselin s aminy nebo lysin obsahujícími peptidy a proteiny bez potřeby externího činidla. Na základě pozitivních výsledků experimentů se squaramátem modifikovanou DNA, jsem v druhé části práce vyvinula a připravila squaramátem...
|
|
|
Quantum dots and their interaction with biomolecules
Stanisavljević, Maja
V této práci byly syntetizovány kvantové tečky pomocí mikrovlnné syntézy a povrchově modifikovány různými způsoby pro umožnění interakce s vybranými biomolekulami. Mezi použité konjugační způsoby patří nespecifická interakce, streptavidin-biotin konjugace a vazba pomocí syntetického peptidu. Kvantové tečky pokryté glutathionem o velikosti 2 nm umožnily interakci s velkým žlábkem DNA, zatímco kvantové tečky pokryté streptavidinem specificky interagovaly s biotinylovaným oligonukleotidem. Nakonec, streptavidin-biotin interakce bylo využito i pro vazbu apoferitinu s magnetickými částicemi.
|
|
|
Modified nucleotides and DNA for electrochemical labelling and defined display of small molecules
Krömer, Matouš ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato práce je zaměřena na enzymatickou syntézu sond pro elektrochemické značení, biokonjugace a ve své závěrečné kapitole, postavené na poznatcích získaných v předchozích částech, popisuje metodu pro přípravu vysoce funkcionalizované DNA modifikované na bázích, využitelnou pro kontrolovanou multivalentní prezentaci glykosidů. V první částí byla nalezena metoda pro přípravu nukleotidů nesoucích diolové skupiny. Sonogashirova reakce umožnila přístup k diolům připojeným přes alkynovou spojku, následná katalytická hydrogenace, poprvé popsána v literatuře, poté poskytla cestu k diolům připojeným přes flexibilní sp3 hybridizovanou spojku, a to bez použití chránících skupin. Štěpení diolů připojených k nukleotidům přes sp3 spojku, nikoliv však přes alkynovou spojku, vedlo ke vzniku nukleotidu modifikovaného alifatickým aldehydem. Všechny nukleotidy byly dobrými substráty pro KOD XL DNA polymerázu, jak v reakci extenze primeru, tak v polymerázové řetězové reakci, vyjma aldehydem modifikovaného dUTP, který byl akceptován v PEX, ale produkty PCR reakce vznikaly pouze ve směsích s přirozeným dTTP. Toto omezení bylo překonáno štěpením diolů až po inkorporaci do DNA, čímž také vznikla DNA modifikovaná aldehydovými skupinami. Všechny reaktivní sondy byly použiti pro biokonjugace s fluorescenčním hydrazeinem, pro...
|
|
|
Modification of nucleic acids by reactive groups for bioconjugations and cross-linking with lysine-containing peptides and proteins
Ivancová, Ivana ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
V první části dizertační práce jsem vyvinula reaktivní DNA sondu pro selektivní cross- linkování s lysinovými zbytky DNA vazebních proteinů. Připravila jsem 2'-deoxycytidin 5'-O- monofosfát a trifosfát nesoucí v poloze 5 squramátovou skupinu navázanou přes propargylaminovou spojku. Monofosfát byl použit jako modelová sloučenina na testování reaktivity tohoto smíšeného squaramátu v cross-linkových reakcích s lysinem a krátkými peptidy obsahujícími lysin. Squaramátem modifikovaný 2'-deoxycytidin 5'-O-trifosfát byl dobrým substrátem pro KOD XL polymerázu pro enzymovou syntézu DNA metodou extenze primeru (PEX) a taky metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). Squaramátem modifikovaná DNA tvoří stabilní diamidové vazby s primárními aminy. Reaktivitu modifikované DNA jsem testovala v biokonjugačních reakcích se sulfo-Cy5- aminem a s peptidy obsahujícími lysin. Poté byla squaramátem modifikovaná DNA úspěšně kovalentně připojena k histonovým proteinům bohatým na lysin. Reaktivní, squaramátem modifikovaný nukleotid vykazoval potenciál pro další biokonjugační reakce nukleových kyselin s aminy nebo lysin obsahujícími peptidy a proteiny bez potřeby externího činidla. Na základě pozitivních výsledků experimentů se squaramátem modifikovanou DNA, jsem v druhé části práce vyvinula a připravila squaramátem...
|
|
|
Synthesis of chelators for use in diagnostic imaging
Kretschmer, Jan ; Polášek, Miloslav (vedoucí práce) ; Kubíček, Vojtěch (oponent) ; Hrubý, Martin (oponent)
Sloučeniny kovů mají v medicíně zásadní roli jako součást léčebných nebo diagnostických přípravků. V naprosté většině případů však jejich vlastnosti nelze zcela využít v jejich volné iontové formě. K využití jejich plného potenciálu se používají organické molekuly schopné jejich zabudování. Tyto molekuly se nazývají chelátory a jsou hlavním tématem této disertační práce. Jejich nejdůležitější funkcí je samozřejmě chelatace, koordinace kovu, ale chelátory mohou poskytovat i další užitečné funkce. Z tohoto důvodu se práce zabývá návrhem, syntézou a použitím polyfunkčních chelátorů. Předkládaná práce se skládá ze dvou částí: DO3A-Hyp První část práce se zabývá chelátory, které lze použít jako aminokyseliny pro inkorporaci lanthanoidů do peptidů. Tyto chelátory zajišťují krátké a rigidní zabudování lanthanoidů do peptidového řetězce. Pro demonstraci schopností připravených stavebních bloků byly syntetizovány tripeptidy obsahující dva chelátory s centrální aminokyselinou nesoucí CF3 skupinu. V tripeptidu byly následně kombinovány dva paramagnetické kovy a bylo ukázáno, že takovýto rigidní systém poskytující blízké připojení lze použít pro kombinaci tenzorů magnetické susceptibility přítomných paramagnetických kovů. Tenzory magnetické susceptibility byly následně použity pro manipulaci s 19 F NMR posunem...
|
|
|
Application of fluoroalkyl hypervalent iodine reagents in C-H functionalization of small molecules and aromatic amino acid residues
Rahimidashaghoul, Kheironnesae ; Beier, Petr (vedoucí práce) ; Kvíčala, Jaroslav (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
SOUHRN Chemie fluoralkylových činidel hypervalentního jódu dosáhla v posledních letech velkého uplatnění. Jak je nastíněno v úvodu práce, tyto sloučeniny jsou vysoce atraktivní jako potenciální léčiva, pokročilé materiály a agrochemikálie. Navzdory tomuto širokému využití fluoralkylových činidel hypervalentního jódu, jejich aplikace v biologických studiích není příliš rozvinutá. Cílem této práce je vývoj nových metod probíhajících za mírných podmínek a bez využití kovů, které by vedly k aplikaci v biologických studiích. V této práci byly prozkoumány dva druhy využití fluoralkylových činidel hypervalentního jódu pro značení biomolekul. První část práce se zabývá využitím již dříve zmíněných Togniho CF3 činidel a jejich tetrafluorethylových analogů při radikálových fluoralkylacích elektronově bohatých substrátů jako jsou deriváty indolu a pyrrolu s využitím askorbátu sodného jako redukčního činidla. Tato transformace poskytuje trifluormethylované a 1,1,2,2-tetrafluorethylované produkty ve středně dobrých až vysokých výtěžcích. Tato činidla byla také použita pro značení několika peptidů a proteinů obsahujících aromatické aminokyseliny. Pomocí výše zmíněné reakce byly tyto peptidy a proteiny obsahující elektronově bohaté aromatické řetězce jako Trp, Phe, Tyr a His fluoralkylovány s vysokou selektivitou vůči...
|
|
|
UV zářením indukované kvantové tečky a jejich použití v biosenzorech
Pavelková, Kamila
Bakalářská práce je zaměřena na studium kvantových teček, polovodičových nano-krystalů, jejichž velikost je v rozmezí 1–10 nm. V současné době je o kvantové tečky velký zájem z důvodu široké škály využití v nejrůznějších oborech a výhodným vlastnos-tem jako je schopnost fluorescence, odolnost vůči degradaci a vysoký kvantový výtěžek. Cílem této práce bylo vytvoření uceleného přehledu o kvantových tečkách, jejich stručná charakterizace. Dále byly popsané nejrůznější způsoby jejich syntézy a využití těchto nanočástic v optických biosenzorech. Experimentální část byla věnována optimalizaci přípravy termálně a UV zářením indukovaných kvantových teček.
|
host ::
RSS.